مواد لازم براي واكنش PCR:

1. آنزيم DNA Polymerase.

آنزيم DNA پلي مرازي كه در PCR استفاده مي‌شود از منشا باكتري Thermus aquaticus مي‌باشد. اين آنزيم مقاوم به حرارت بوده و از عوامل بسيار مهم گسترش تكنيك PCR در آزمايشگاه­هاي تحقيقاتي و كلينيكي مي‌باشد. در واكنش‌هاي PCR معمولي، از آنزيم Taq DNA polymerase استفاده مي‌شود. غلظت زياد آنزيم گاهي منجر به كاهش اختصاصي بودن واكنش مي‌شود كه بصورت smear بر روی ژل آگارز یا پلی­ اکریل­آمید خود را نشان مي‌دهد و چنانچه مقدار آنزيم كمتر از حد موردنياز باشد، محصول به  اندازه كافي توليد نمي‌شود.

آنزيم Taq پليمراز بصورت يك زنجيره پلي‌پپتيدي واحد با وزن مولكولي KD90 بوده كه واجد فعاليت پلي‌مرازي3'à5' بوده و فاقد فعاليت اگزو نوكلئازي 5'à3'   مي­باشد. اين آنزيم دارای حداكثر فعاليت در9 = PH و دماي Cº72 است و همچنين قادر است در هر ثانيه 60 باز را به رشته DNA اضافه كند و فاقد خاصيت Proof reading مي‌باشد. نيمه عمر اين آنزيم در Cº95 حدود 40 دقيقه است. 

2.  آغازگرها (پرایمر­ها):

در واكنش PCR پرايمرها به دو طرف توالي هدف متصل شده و امكان شروع فعاليت پليمرازي آنزيم DNA پليمراز را فراهم مي‌كنند. بنابراين اولين خصوصيت پرايمر، توالي صحيح آن براي مكان موردنظر جهت تكثير است.

ـ طول پرايمر بايد حدوداً بين bp 25 ـ 18 ‌باشد، که ويژگي کافي براي اتصال به يک توالي هدف منحصر به فرد را حتي در مورد الگوهاي اوليه، به پيچيدگي DNA ژنومي انسان فراهم کند.

ـ توزيع يكنواختي از توالي‌هاي غني از G/T,A/T مي‌بايستي وجود داشته باشد.

ـ انتهاي 3' پرایمر­های بكار رفته در يك واكنش نبايد مكمل باشند تا باعث دايمري شدن پرايمرها نشوند (Primer - dimers) كه باعث كاهش عملكرد خواهند شد.

3.  داكسي نوكلئوتيد تري فسفات (dNTP)

نوكلئوتيدها از مواد مهم موردنياز واكنش PCR مي‌باشند. آنزيم‌هاي پليمراز سنتز زنجيره پلي‌نوكلئوتيدي را از منومرها كاتاليز مي‌كنند. همانطور كه در سنتز طبيعي DNA از چهار نوع  نوكلئوتيد استفاده مي‌شود، در واكنش PCR نيز چهار نوع: dATP, dTTP, dGTP, dCTP مورد نياز است. غلظت μM250 ـ 200 (mM 2/0) از هر نوع نياز است. بايد توجه داشت كه غلظت برابري از هر نوع نوكلئوتيد استفاده شود زيرا عدم تعادل منجر به كاهش دقت آنزيم Taq مي‌شود.

dNTP باعث كاهش ميزان يون Mg2+ آزاد مي‌گردد. بنابراين با فعاليت پليمرازي آنزيم تداخل كرده و منجر به كاهش Annealing پرایمر مي‌گردد. به همين دليل غلظت بالاي dNTPS، مهاركنندة واكنش مي‌باشد.

4. يون منيزيم (Mg2+)

تمام آنزيم‌هاي DNA پليمراز مقاوم به حرارت براي فعاليت به كاتيون‌هاي دو ظرفيتي (معمولاً Mg2+) نياز دارند. با افزايش غلظت يون منيزيم، قدرت اتصال پرايمرها افزايش مي‌يابد و دماي Annealing بالاتري نياز مي‌باشد و همچنين تمايل اتصال پرايمرها به توالي هدف و اتصال غيراختصاصي آنها به توالي‌هاي غير هدف افزايش مي‌يابد كه از طرفي باعث افزايش حساسيت واكنش مي‌گردد و از طرفي ديگر اختصاصي بودن را كاهش مي‌دهد. همچنين تشكيل دايمر پرايمري با افزايش غلظت يون منيزيم افزايش مي‌يابد كه باعث تكثير غيراختصاصي و تجمعي از قطعات كوچك مي‌شود.

5.  بافر جهت حفظ PH

بافر Tris – HCL با1/8– 3/8 = PH در غلظت mM10 بافر استاندارد جهت PCR مي‌باشد. در دماي Cº72، PH محلول افت مي­كند و به حدود 2/7 مي‌رسد كه PH مناسب براي فعاليت آنزيم پلي‌مراز) 5/7 ـ 7 (ااست.

6.DNA الگو

الگو شامل توالي‌هاي هدف است كه مي‌تواند به شكل تك رشته يا دو رشته‌اي باشد. 1μg از DNA شامل حدود 10⁵ × 3 كپي از هر ژن مي‌باشد.

7. آب مقطر استريل

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

روش انجام PCR

ابتدا در هر ميكروتيوب0.5  ميلي‌لیتري 24 ميكروليتر از مخلوط واكنش PCR مي‌ريزيم. ميزان آنزيم DNA پليمراز اضافه شده 0.5 ـ 0.2  ميكروليتر براي هر واكنش مي‌باشد. 1 ميكروليتر از هر يک از پرايمر ها،  سپس 100 نانوگرم (μl2) از DNA ژنومي هر بيمار را به مخلوط واكنش اضافه كرده و كاملاً آنرا مخلوط مي‌نماييم. پس از انجام يك میکروسانتريفیوژ كوتاه و سريع، نمونه‌ها را در دستگاه PCR قرار مي‌دهيم تا با تنظيم دستگاه و روشن نمودن آن واكنش زنجيره‌اي پليمراز (PCR) آغاز گردد. در بعضی مواقع براي اطمينان از صحت عمل، استفاده ازسه نمونه كنترل، كه DNA يك فرد سالم، ناقل و مبتلا مي‌باشد، ضروري است. در انجام تمامي مراحل تهيه نمونه براي PCR، بايد ميكروتيوب­ها و آنزيم پليمراز در ظرف يخ قرار داشته باشند. در شکل زیر دو نمونه از دستگاه­های PCR شرکت Eppendorf   نشان داده شده است.

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

سیکل های PCR:

الف) مرحله واسرشت :(Denaturing)

DNA  دو زنجيره‌اي در دمايي متناسب بامقدار G + C آن دناتوره مي­شود. هرچه درصد G+C بيشتر باشد دماي بالاتري جهت جدا كردن رشته‌هاي DNA موردنياز است. بطور معمول دماي Cº95 به مدت 30 تا 40 ثانيه براي اين مرحله درنظر گرفته مي‌شود. در برخي موارد دماي Cº97 يا بالاتر به مدت 15 ـ 10 ثانيه نيز مورداستفاده قرار مي گيرد. چنانچه زمان يا دما در اين مرحله كافي نباشد، DNA الگو بطور كامل باز نمي‌شود و درنتيجه باعث كاهش محصول مي‌گردد. و دما يا زمان بيش از اين مرحله باعث كاهش در عملكرد مواد واكنش بخصوص در آنزيم پليمراز مي‌گردد. نيمه عمر آنزيم DNA پليمراز در Cº 5/97 حدود 6ـ5 دقيقه در دماي Cº 95 حدود 40 دقيقه و در دما Cº 5/92 حدود 130 دقيقه مي‌باشد.

ب) مرحله اتصال :(Annealing)

دماي مورداستفاده در مرحله اتصال بسيار مهم است. اگر دماي Annealing خيلي بالا باشد، پرايمرها به صورت ضعيف متصل مي‌شوند و محصول PCR خيلي ضعيف خواهد بود. اگر دماي خيلي پايين باشد اتصال غيراختصاصي پرايمرها اتفاق مي‌افتد و قطعات غيراختصاصي DNA ايجاد مي‌شود. هرچه مقدار GC پرايمر، غلظت و طول آن بيشتر باشد، دما و زمان گرفته شده در اين مرحله بيشتر خواهد بود. بالا بودن دماي اتصال به ويژه در سيكل‌هاي اوليه (5 سيكل اول) باعث افزايش اختصاصي بودن واكنش مي‌شود.

ج) مرحله گسترش :(Extension)

 دما در اين مرحله Cº 72 درنظر گرفته مي‌شود و زمان موردنياز به هدف و غلظت آن بستگي دارد. معمولاً براي قطعات كوچكتر از bp500 مدت 30 ثانيه جهت Extention كافي است و براي قطعات kb1 مدت زمان 60 ثانيه كافي خواهد بود. برخي از محققان در سيكل آخر يك Final Extention درنظر مي‌گيرند كه حدود 5 دقيقه مي‌باشد كه باعث كامل شدن كليه محصول‌هاي تكثير شده مي‌گردد.