تاريخ : دوشنبه ۱۱ شهریور ۱۳۹۲ | | نویسنده : سپیده فامیل ایرانی
 

نحوه انجام آزمایش:

معمولاً به دو دلیل از مریستم نوک ریشه برای مطالعه کاریوتایپ استفاده می­گردد:

1) در این مناطق تقسیم شدید است.

2) در بذری که در حال جوانه زدن است ابتدا ریشه جوانه می­زند و جداسازی آن راحت­تر از  مریستم ساقه است. برای انجام این آزمایش می­توان از بذور کاملاً رسیده گندم، جو، غلات، کتان و... استفاده کرد.

ابتدا بذور کاملاً رسیده گندم و شاهدانه را جمع آوری کرده و آن­ها را به مدت  20َ -15َ جهت ضدعفونی در درون محلول آب ژاول 10%  قرار می­دهیم.

نحوه ریشه ­دار کردن بذر: 

پتری دیش­های اتو کلاو شده را برداشته، کاغذ صافی مرطوبی را کف آن قرار داده و بذور را با فاصله روی آن قرار می­دهیم.

 

نکته) در خانواده غلات، بعضی بذور نیازمند یک پیش تیمار سرمایی­اند، پس بعد از مرحله بالا باید 24 ساعت درون یخچال (4-0) نگهداری کنیم تا خواب بذر شکسته شده و آماده جوانه زنی شود.

بعد از 24 ساعت، پتری را بیرون آورده و در دمای اتاق یا انکوباتور در دمای 22- 20 درجه گذاشته تا شروع به جوانه زنی کند.

نکته) باید تاریک باشد تا سریع­تر جوانه بزند.
نکته) هر روز باید چند بار به پتری­ها سر بزنیم تا آب آن­ها خشک نشود و شاخص میتوزی ( تعداد کروموزوم­های در حال تقسیم) کاهش نیابد.

معمولاً بین  5- 3 روز رشد ریشه­ها تحریک شده و شروع به جوانه زنی می­کنند.

نکته) طول ریشه در گیاهان مختلف متفاوت است ولی حداکثر طول نیم تا یک سانتی­متر ریشه زنی کافی است.
نکته) باید دقت کرد که ریشه­ها با کاغذ صافی ارتباط داشته باشند وگرنه شاخص میتوزی کاهش می­یابد.

سپس یک مرحله پیش تیمار داریم که با چند روش انجام می­گیرد. این مرحله برای مطالعه کروموزو­های مرحله میتوزی ضروری است.

این پیش تیمار 2 هدف اصلی دارد:

1) جلوگیری از تشکیل میکروتوبول­ها و رشته­های دوک در میتوز، پس کروموزوم­ها در متافاز به­دام افتاده، باقی می­مانند و شاخص میتوزی افزایش می­یابد.

2) ایجاد کروموزوم­های متراکم و فشرده پس شمارش کروموزومی آسان­تر می­شود.

    در غلات وقتی ریشه­ها به اندازه مناسب رسیدند برداشته و در زمان مشخص داخللوله آزمایشی که حاوی آب سرد است قرار داده، آن را درون ظرف حاوی آب یخ قرار می­دهیم. سپس تا 24 ساعت آن را درون یخچال می­گذاریم.

    محلول هیدروکسی لیزین دو هزارم مولار باعث مختل کردن رشته­های دوک شده،پس کروموزوم­ها در مرحله متافازی قرار گرفته و مانع انجام ادامه تقسیم می­شود. زمان استفاده از این محلول 5-3 ساعت است. سپس در دمای محیط قرار می­دهیم.

نکته) شیشه این محلول به­علت حساسیت به نور باید در درون فویل قرار گیرد.

نکته) به­ جای این ماده می­توان از کلشی سین، آلفا برومو نفتالین و پارا دی کلرو بنزن استفاده می­کنیم.
نکته) کلشی سین یک ماده سمی و جهش ­زا است.
نکته) در این آزمایش از این روش استفاده نمودیم.
گام بعدی فیکسیشن است. برای این کار  از محلول کارنوی استفاده می­کنیم
(نسبت 3:1 الکل 96 درجه و استیک اسید گلایسیال)
نکته) بهتر است تازه تهیه شده باشد.
نکته) زمان فیکساتیو 48- 24 ساعت در دمای محیط می­باشد.
نکته) قبل از فیکس کردن باید با آب شستشو دهیم.
نکته) اگر نتوانستیم این مراحل را پشت سرهم انجام دهیم باید آن­ها را در الکل 70 درصد در دمای یخچال نگهداری کنیم.
سپس آن را در محلول اسید استیک ا نرمال به مدت 20َ دردمای 60ْ  در بن ماری یا روی چراغ الکلی حرارت می­دهیم تا دیواره کاملاً نرم و حل شود.
سپس آن را درون رنگ استوکارمن 2 درصد به مدت 30َ تا ا ساعت قرار می­دهیم.
بعد نوک ریشه آن­ها را جدا کرده روی لام قرار داده، لامل را روی آن گذاشته و به مدت 10َ تا 15َ اسکواش می­نماییم.
نکته)
شاید از بین 10 ریشه، تنها در 2 ریشه سلول خوب مشاهده شود.


برچسب‌ها: روش تهیه کاریوتایپ گیاهان, سیتوژنتیک